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              干制水產品中四環素類藥物殘留和N-亞硝胺的檢測方法思考

              來源: www.halxjx.net 發布時間:2021-10-21 16:34
              論文地區:中國 論文語言:中文 論文類型:農業論文
              這是一篇優秀的農業論文范文,主要從干制水產品中四環素類藥物殘留和N-亞硝胺的檢測方法思考與分析,隨著經濟的發展,我國現已成為世界第一漁業生產大國、水產品貿易大國和主要遠洋漁業國家,在水產養殖等一些領域已經
                 這是一篇優秀的農業論文范文,主要從干制水產品中四環素類藥物殘留和N-亞硝胺的檢測方法思考與分析,隨著經濟的發展,我國現已成為世界第一漁業生產大國、水產品貿易大國和主要遠洋漁業國家,在水產養殖等一些領域已經達到世界先進水平。同時,現代漁業產業體系初步建立,漁業科技支撐也不斷增強,以“兩帶一區”為代表的優勢水產品養殖區域布局基本形成,水產養殖產業也全面推進。

                 摘要:建立一種以 MWCNTs 復合材料為吸附劑的 m-PFC 凈化裝置,采用 QuEChERS方法結合 HPLC 對干制水產品中的四環素類抗生素殘留進行檢測,通過色譜條件的優化,使目標物獲得有效的分離,此外優化了萃取條件,吸附劑材料和凈化程序等參數,最終選取 0.1 mol/L 的 Na2EDTA-Mcllvaine 和 0.1%甲酸乙腈作為萃取劑,NaC l和 Na2SO4 作為鹽析材料,C18、MgSO4 和 MWCNTs 作為吸附劑進行凈化。

              1 緒論

              1.1 干制水產品概述
              1.1.1 干制水產品開發利用現狀
              隨著經濟的發展,我國現已成為世界第一漁業生產大國、水產品貿易大國和主要遠洋漁業國家,在水產養殖等一些領域已經達到世界先進水平。同時,現代漁業產業體系初步建立,漁業科技支撐也不斷增強,以“兩帶一區”為代表的優勢水產品養殖區域布局基本形成,水產養殖產業也全面推進。
              中國水生生物市場是世界上最大的市場,而且增長迅速,從上個世紀 90 年代,我國水產品的生產和消費量就穩居世界第一[1],水產品年總產量占世界總產量的 30%左右[2]。而山東半島是我國水產養殖業的主要地區,同時也是我國出口水產品的主要出產地[3]。山東半島瀕臨渤海、黃海,海岸線全長約 1700 km,沿海灘涂面積約 500km2,海產資源豐富,海洋捕撈業以及海產品加工業發達。目前,各種海產品如魚類、蝦類、貝類等因其味道鮮美,營養豐富已經成為人們的日常消費品。然而,新鮮的海產品很容易腐爛,對運輸條件要求較高,阻礙了產品的流通和水產行業的發展,因此通過一定的手段延長其貨架期至關重要。目前,冷藏、冷凍、鹽漬、罐裝、烘干和熏制是最常用的有效保存技術[4]。比如魚糜制品、罐頭產品、鹽漬水產品以及干制水產品等。其中,干制水產品比如烤魚片、魷魚絲、海米、蝦皮、小魚干等由于其獨特的風味和較長的保質期,在中國占一定比例,并在中國廣泛消費[5]。
              1.1.2 干制水產品有害污染物概述
              近年來,干制水產品成為新鮮水產品深加工的標志性產業,在沿海城市中占據重要地位。隨著漁業的快速發展和人們生活水平的提高,在注重水產品營養價值的同時,其安全性也越來越受到人們的廣泛關注[6]。近幾年發生的“多寶魚事件”、“孔雀石綠事件”、“貝類毒素”、“藻類中的重金屬問題”、“敵敵畏海參”、“烤魚片中 N-二甲基亞硝胺超標”等問題[7],都給我國水產養殖業造成巨大損失,因此開發安全快速的海產品質量檢測控制技術,對于漁業產業的可持續發展具有重要意義。
              水產品的質量安全問題日益突出,主要表現在以下幾個方面:一是一些不良企業隨意排放廢水、廢棄、廢渣,有毒有害物質對海洋食品安全衛生造成嚴重隱患;二是在海產品養殖加工過程中為追求經濟效益違規用藥,從而影響海洋食品的食用安全;三是海洋食品中的生物毒素和有害微生物對消費者的身體健康和生命安全造成威脅;四是違規使用加工助劑和添加劑;五是水產品的特異性蓄積通過食物鏈進入人體內,帶來安全隱患。因此建立安全快速檢測方法對有害污染物進行檢測是保障漁業產業可持續發展的迫切需求。
              ..............................

              1.2 水產品中有害污染物的前處理方法
              樣品前處理是整個分析方法最重要的組成部分,它對后續的分析結果有很大的影響,是對分析物進行明確識別和定量的前提。樣品制備通常包括提取、凈化和濃縮步驟,然后進行最終分析[13]。提取方法通常是從樣品中分離出殘留污染物,而凈化方法的目的是分離共提取的基質成分,以獲得更純凈的樣品提取物[14]。對有毒有害物質的分析過程則在于消除干擾儀器測定的主要基質成分,如脂質、蛋白質、維生素等成分。
              1.2.1 液液萃取
              液液萃取(Liquid-Liquid Extraction,LLE)是一種經典的樣品前處理方法,目前仍廣泛用于各種藥物的檢測。LLE 是一種基于分析物在兩種互不相溶的液相(通常是水和有機溶劑)中的不同分布(相對溶解度)的分離過程,該過程受分配平衡控制。分析物的提取是從第一個液相轉移到第二個液相,這是通過兩相之間的溶解度差異來實現的[15]。乙腈、丙酮、乙酸乙酯和二氯甲烷等均可作為萃取溶劑。例如Kim 和 Shin[16]建立了一種 LLE 方法,用于從電子煙替代液中提取和純化煙草特異性亞硝胺。在使用各種萃取溶劑(例如戊烷,甲基叔丁基醚,二氯甲烷和乙酸乙酯)評估丙二醇的效果后,將二氯甲烷用于簡單的萃取過程,以實現更高的回收率。Desmarchelier 等人[17]建立了一種 LLE 前處理方法結合 LC-MS/MS 檢測食品中 5 種四環素及其同分異構體的方法,用乙二胺四乙酸(EDTA)和乙腈進行液液萃取,然后進行冷凍步驟,以促進低溫下的相分離,樣品萃取物經正己烷脫脂后通過 LC-MS/MS法進行檢測。盡管 LLE 在一些方面表現出優勢,然而仍存在一些不可忽視的缺點,例如乳液的形成、較差的相分離、難以自動化以及使用劇毒的有機溶劑等,這會導致大量環境污染物的生成。
              1.2.2 分散液液微萃取
              分散液液微萃取(Dispersive liquid-liquid microextraction,DLLME)是基于一個由三個組分組成的溶劑系統:萃取溶劑、分散溶劑和樣品溶液。原理圖如圖 1-1 所示,利用分散溶劑與其他兩種溶劑的混溶性,萃取溶劑可以作為非常細小的液滴分散到水相中形成混濁溶液。離心后,用微量注射器將沉淀在錐形試管底部的萃取溶劑顆粒取出進行分析。與其他方法相比,由于分析物與細小液滴之間有足夠的接觸面積,大大加快了萃取過程,縮短了分析時間。Rodríguez 等人[18]將 UAE 與 DLLME 聯用,從雞蛋樣品中分離出四環素,然后使用流動分析法進行分光光度法測定,LOD 為 6.4μg/L~11.1 μg/L,加標回收率為 85.7%~96.4%,RSD 小于 9.8%,結果令人滿意。
              圖 1-1 DLLME 程序
              圖 1-1 DLLME 程序
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              2 基于 MWCNTs 快速濾過型凈化方法結合 HPLC 檢測干制水產品中的四環素類抗生素殘留

              2.1 前言
              四環素(Tetracyclines,TCs)是一種天然或半合成的抗生素,對多種革蘭氏陽性菌(葡萄球菌、鏈球菌、肺炎球菌、腸球菌)和革蘭氏陰性菌(淋球菌、霍亂、痢疾桿菌、布魯氏菌)均表現出抗菌活性[13],因此,廣譜作用的四環素抗生素已經在世界范圍內被廣泛應用。四環素類化合物具有相似的化學結構,而且四環素還是很強的螯合劑,易與二價金屬離子發生螯合作用,主要的螯合部位是 11,12B 雙酮體系,最常用四環素及化學結構如圖 2-1 所示[48]。
              圖 2-1 最常用四環素類藥物的化學結構
              圖 2-1 最常用四環素類藥物的化學結構
              由于其廣譜抗菌性和低成本,四環素在動物養殖以及魚類養殖領域被廣泛應用,用于預防和治療疾病,還用作飼料添加劑以促進動物快速生長和體重增加[49]。四環素類抗生素的作用機理是基于蛋白質合成抑制,其通過抑制翻譯而導致細胞生長破壞。藥物的廣泛使用可能導致動物源性食品中的藥物殘留,大量使用也會使動物對其產生抗藥性,對消費者的健康造成潛在的不利影響,目前已成為全球公共衛生系統的一個嚴重問題[17]。
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              2.2 材料與方法
              2.2.1 材料、試劑和儀器設備
              市售干制水產品如烤魚片、小魚干、魷魚絲等,主要儀器設備和試劑分別列于表 2-2、表 2-3。
              表 2-2 實驗儀器
              表 2-2 實驗儀器
              2.2.2 標準溶液的配制
              單標儲備溶液的配制:用萬分之一分析天平分別準確稱取 TC、OTC 和 CTC 各50.0 mg 精確至 1.0 mg,置于 50 mL 容量瓶,用甲醇定容至刻度,常溫超聲溶解,混勻,于-20 ℃冷藏避光保存。
              混合標準工作溶液:分別量取 3 種藥物單標儲備溶液各 500 μL 于 50 mL 容量瓶中,稀釋成 10 μg/mL 的混合標準儲備液,然后再量取一定量的混合標準儲備液,用甲醇稀釋系列濃度的標準工作液,將該系列濃度標準溶液置于 4 ℃冰箱冷藏避光保存,現配現用。
              0.1 mol/L Na2EDTA-Mcllvaine 緩沖溶液:將 1 L 0.1 mol/L 檸檬酸溶液與 625 mL0.2 mol/L 磷酸氫二鈉溶液混勻,并加入 60.5 g Na2EDTA 溶解、混合均勻,用 H3PO4或 NaO H 調節 pH=4.0 左右。
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              3 基于改良 QuEChERS 方法結合 GC-MS 檢測干制水產品中的 9 種 N-亞硝胺........24
              3.1 前言.......................................24
              3.2 材料與方法..................................27
              4 總結與展望.........................................40

              3 基于改良 QuEChERS 方法結合 GC-MS 檢測干制水產品中的 9 種 N-亞硝胺

              3.1 前言
              N-亞硝胺(N-nitrosamines,NAMS)是一種強致癌物作用的化合物[78],這些化合物在食品中的存在已成為嚴峻的公共衛生問題,國際癌癥研究機構(IARC)已將N-亞硝胺類化合物列為對人類最具致癌性的物質[19,79],將 NDMA 和 NDEA 列為 2A類致癌物,此外超過 10 種揮發性和非揮發性亞硝胺被歸類為 2B 類致癌物質。它們在鼠傷寒沙門氏菌的艾姆斯測驗試驗中顯示出突變活性,并在大鼠、小鼠、倉鼠、豚鼠和兔子中引發致癌效應[80,81]。NAMS 是一組含有 R2N-NO 的有機化合物,最常見的 9 種揮發性 NAMS 以及化學式、分子式和分子量如表 3-1 所示。
              表 3-1 9 種 N-亞硝胺的結構式、分子式和分子量
              表 3-1 9 種 N-亞硝胺的結構式、分子式和分子量

              近年來食品安全日益受到重視。人類接觸 N-亞硝胺類化合物的主要來源是食用各種食物,而在食物中,這些 NAMS 是由次胺與亞硝化劑(如硝酸鹽或亞硝酸鹽)反應形成的[82]。目前已經在各種樣品中檢測到 NAMS,例如水[83–85]、醬油[86,87]、肉制品(香腸[88–90],培根[34],烤肉[19])、腌制產品(泡菜[91],咸鴨蛋[92]、干腌魚[93,94])等樣品。由于其抗菌特性,亞硝酸鹽通常被用作食品防腐劑;因此,亞硝酸鹽可以與肉質品中存在的仲胺反應生成 NAMS,從而增加患癌癥的風險。除了人工添加,在烹飪過程中也可以形成 NAMS,例如通過煙熏、烘焙和油炸。此外在啤酒中也檢測出NAMS[95,96],啤酒中的亞硝酸鹽主要是通過細菌還原天然存在于水中的硝酸鹽而產生,胺的來源是大麥中存在的谷氨酰胺中的二甲胺。除了食物來源,NAMS 還可以存在于環境[97]和化妝品[98]中,甚至可以在人體內合成。
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              4 總結與展望


              本論文采用 QuEChERS 方法與 m-PFC 裝置相結合,以靈敏度較高的 HPLC 和GC-MS 為檢測手段,對干制水產品中的四環素類抗生素殘留和 N-亞硝胺進行檢測。通過改進 QuEChERS 方法,優化萃取條件與吸附條件,對方法學進行驗證,成功應用到干制水產品的檢測中。
              1、建立一種以 MWCNTs 復合材料為吸附劑的 m-PFC 凈化裝置,采用 QuEChERS方法結合 HPLC 對干制水產品中的四環素類抗生素殘留進行檢測,通過色譜條件的優化,使目標物獲得有效的分離,此外優化了萃取條件,吸附劑材料和凈化程序等參數,最終選取 0.1 mol/L 的 Na2EDTA-Mcllvaine 和 0.1%甲酸乙腈作為萃取劑,NaC l和 Na2SO4 作為鹽析材料,C18、MgSO4 和 MWCNTs 作為吸附劑進行凈化。經方法學驗證,3 種四環素類抗生素在相應的濃度范圍內線性良好,相關系數大于 0.9989,LOQ 在 15~23 μg/kg 范圍內,在 50、100、200 µg/kg 三個不同濃度加標水平下,整體回收率良好,RSD 為 1.6%~10.6%,可用于實際樣品的檢測。
              2、基于改良 QuEChERS 方法結合氣相色譜質譜聯用,建立了干制水產品中 9種 N-亞硝胺的檢測。通過優化色譜、質譜條件參數,使得 9 種 NAMS 得到有效的分離,對 QuEChERS 方法進行改進,優化了萃取條件與吸附條件,獲得最佳的前處理方法,最終選取乙腈為萃取溶劑,PSA、MgSO4、C18 和 MWCNTs 復合材料為吸附劑。結果顯示 9 種 NAMS 在相應濃度范圍內線性良好,相關系數為 0.9918~0.9999,LOD 和 LOQ 分別為 0.11~0.96 μg/kg 和 0.36~3.18 μg/kg,除部分化合物之外,整體回收率在可接受范圍內,RSD 在 0.2%~19.1%范圍內。此外還比較了烤魚片、魷魚絲、小魚干和蝦米四種不同樣品之間的回收率,發現在不同基質中的回收率無明顯差異,可用于干制水產品中 NAMS 的檢測。此外分析了近三年干制水產品中 NDMA 超標的主要因素,為干制水產品中 NDMA 的限量標準提供參考依據。
              參考文獻(略)


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